AVALIAÇÃO DOS PRINCIPAIS COMPOSTOS FENÓLICOS, ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E BIODISPONIBILIDADE DAS FOLHAS DE OLIVA CULTIVADAS na REGIÃO SUDESTE DO BRASIL.

RESUMO

A oliveira é uma das culturas mais antigas no mundo, concentrando sua maior produção na região do Mediterrâneo. Nas últimas décadas, no Brasil, houve expansão desta cultura, sendo seu principal foco a produção do azeite de oliva. Durante a época de poda, muitas folhas são descartadas sem um destino apropriado. Nestas folhas existem grande quantidade de compostos fenólicos e, com isso, uma ampla variedade de benefícios à saúde humana. Portanto, o objetivo do trabalho é a caracterização destes compostos fenólicos e o comportamento destes frente à sazonalidade, além da avaliação da atividade antioxidante e da sua biodisponibilidade, podendo gerar nas indústrias farmacêutica e alimentícia futura aplicação tecnológica, e ao produtor, agregação de valor a sua produção e aumento de renda.

OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho é a caracterização química das folhas, das três principais cultivares de oliveiras produzidas no Brasil (arbequina, arbosana e koroneiki) quanto aos compostos fenólicos, atividade antioxidante e sua disponibilidade em função das estações climáticas anuais, visando o aproveitamento das folhas para fins tecnológicos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar o teor de fenóis totais em extrato etanólico, pré-selecionado, nas três cultivares (arbequina, arbosana e koroneiki), e nas últimas quinzenas das estações climáticas (primavera, verão, outono e inverno) de 2 anos de produção.

- Quantificar a atividade antioxidante pelos métodos de DPPH e ORAC em cada avaliação realizada no item anterior.

- Avaliar a biodisponibilidade dos fenóis totais em culturas de células CACo-2 para o maior teor de fenóis obtido.

JUSTIFICATIVA

A oliveira é uma planta de clima temperado e por isso ainda se encontra em processo de adaptação ao território brasileiro com sua produção em constante crescimento. Conhecida pelo seu alto teor de compostos fenólicos na matéria seca, estas substâncias acumulam-se essencialmente nos frutos e nas folhas, especialmente durante a fase de crescimento e na primeira fase de maturação, produzidas pelo metabolismo especializado destas plantas, este também definido como o metabolismo de defesa (RANALLI et al., 2006).

Na folha é possível observar, principalmente, a presença de fenóis simples, como o hidroxitirosol (3,4-DHPEA ou 3,4-dihidroxifeniletanol), o tirosol (3-hidroxifeniletanol), o ácido vanílico, o ácido p-cumárico e o ácido cafeico, além dos fenóis mais complexos (secoiridóides) como a oleuropeína e oligstrósido, que apresentam alta atividade antioxidante, propriedades anti-inflamatória, antitumorais e antimicrobiana, além de serem anti-hipertensivos, ajudam a diminuir o colesterol, são cardioprotetores e coadjuvantes no tratamento da obesidade (RANALLI et al., 2006; BONVINO et al., 2018; YAKHLEF et al., 2018; ÖZCAN; MATTHÄUS, 2016).

No Brasil, em condições tropicais, a planta vegeta mais, produzindo grande quantidade de folhas e exigindo do produtor um melhor sistema de condução da planta, com maior demanda em podas. As folhas residuais deste sistema poderiam agregar valor ao produtor, e sua caracterização em relação às condições climáticas brasileiras podem auxiliar o seu potencial uso.

INTRODUÇÃO

A oliveira (Olea europaea L.) é uma das plantas mais cultivadas na região do Mediterrâneo, onde 95% da produção mundial está localizada, destacando-se os países Espanha, Grécia, Itália, Turquia e Marrocos (BOUAZIZ et al., 2008; MOHAMED et al., 2018; FAOSTAT, 2017; YAKHLEF et al., 2018)

A produção das oliveiras no Brasil é recente e está em constante crescimento. As oliveiras se adaptaram muito bem na região da Serra da Mantiqueira, Minas Gerais, São Paulo e algumas regiões do Rio Grande do Sul. Por apresentarem uma adaptação recente, apenas 40% das plantas estão produzindo, representando um aumento de 42,8% entre os anos de 2017 e 2018. Os resultados projetados são bastante promissores, pois estima-se que em 2025 a área plantada aumente em 300% (ZAGO et al., 2019).

Segundo dados da FAOSTAT, 2017, a produção brasileira em 2017 foi de 946 hectares de área cultivada, produzindo cerca de 1250 toneladas de azeitonas, representando apenas 0,006% da produção mundial.

Em crescimento em território brasileiro, estudos sobre composição e qualidade do azeite, análise sensorial, entre outros estão em andamento e já fazem parte de nossa realidade. Entretanto a folha como subproduto ainda é pouco explorada.

As condições de clima subtropical, propiciam maior desenvolvimento vegetativo das plantas quando comparado as de clima mediterrâneo, em detrimento a produção de frutos e este crescimento deve ser controlado por meio de podas, gerando como subprodutos as folhas do olival. Relatos de problemas com o desenvolvimento vegetativo intenso acontecem em Santa Catarina, São Paulo, Minas gerais e Rio Grande do Sul. A elevada altura das plantas também dificulta a colheita, que se manual, necessita ser feita com escadas, que ocasiona riscos aos trabalhadores rurais, e perdas de tempo. Para reduzir problemas de crescimento vegetativo intenso que ocasionam perdas produtivas, três fatores devem ser observados: (i) escolha de cultivares que apresentem menor desenvolvimento vegetativo para plantio em nossas condições; (ii) poda correta, e se necessário várias vezes ao ano; (iii) controle de fertilizações, especialmente de adubação nitrogenada (BERTONCINI, et al., 2010).

Além disso, as folhas correspondem a aproximadamente 10% do peso das azeitonas que são coletadas para a extração do azeite, sendo aproveitadas somente para a alimentação animal, havendo uma perda de potencial nutricional para a saúde humana, devido à sua alta concentração de compostos fenólicos de grande interesse das indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética, possibilitando a potencialização de uso destas substâncias (IRAKLI; CHATZOPOULOU; EKATERINIADOU, 2018; LAMA-MUÑOZ et al., 2019; LEONARDIS et al., 2015).

Sabe-se que estas folhas apresentam alta atividade antioxidante, propriedades anti-inflamatória, antitumoral e antimicrobiana, além de serem anti-hipertensivos, ajudam a diminuir o colesterol, são cardioprotetores e coadjuvantes no tratamento da obesidade (BONVINO et al., 2018; ÖZCAN; MATTHÄUS, 2016; YAKHLEF et al., 2018)

Muitas das atividades obtidas nas folhas, são devidas aos compostos fenólicos. Este grupo de compostos constituem um dos mais numerosos e amplamente distribuídos grupos de produtos naturais no reino vegetal. Mais de 8000 estruturas fenólicas são atualmente conhecidas e entre elas mais de 4000 flavonoides foram identificados, sendo compostos caracterizados como fortes antioxidantes. Quimicamente, os compostos fenólicos são compostos orgânicos caracterizados pela presença de uma hidroxila (OH) ligada a um anel aromático. Os efeitos na saúde dependem da quantidade consumida e da sua biodisponibilidade, e devido à sua elevada diversidade estrutural, esta biodisponibilidade é naturalmente muito influenciável, sendo que os mais comuns na dieta humana não são os mais ativos biologicamente. Tal é justificado por inúmeras razões, como a baixa atividade intrínseca, a absorção intestinal reduzida ou a rápida metabolização e excreção. Não obstante, nem todos os compostos fenólicos são absorvidos com a mesma eficácia, sendo que são extensivamente metabolizados pela microflora intestinal (HARBORNE; WILLIAMS, 2000; SÁ et al., 2012; XIE et al., 2015).

As classes mais importantes de compostos fenólicos nas folhas de oliva incluem álcoois fenólicos, ácidos fenólicos, flavonóides, flavonas e secoiridóides (ÖZCAN; MATTHÄUS, 2016).

Nos álcoois fenólicos da folha estão o 3,4-dihidroxifeniletanol (hidroxitirosol) e p-hidroxifeniletanol (tirosol). O hidroxitirosol, segundo composto fenólico mais abundante nas folhas de oliveira, é um precursor da oleuropeína e sua transformação ocorre a partir de reações químicas e enzimáticas que sucedem durante o amadurecimento. Além disso, é um potente antioxidante, cardioprotetor, antimicrobiano, hipoglicêmico, hipocolesterolêmico e anti-inflamatório (GONZÁLEZ et al., 2019).

Os mais frequentes flavonoides descritos incluem luteolina 7-O-glucosídeo, rutina e apigenina-7-O-glucósidio. Nos ácidos fenólicos temos por exemplo ácido cafeico e clorogênico, nas flavonas das folhas temos, a luteolina-7-glucosídio e apigenina-7-glucosídio e como principal secoiridóide temos a oleuropeína e alguns derivados. A oleuropeína é o composto fenólico mais abundante presente nas folhas de oliveira, tendo uma variação no teor de 60 a 90 mg/g de matéria seca nas folhas e é responsável pelo sabor amargo pela propriedade anti-inflamatória e por ser um potente antioxidante, além de ter propriedades anticancerígenas, antiviral e antimicrobiana (AL-RIMAWI, 2014; ÖZCAN; MATTHÄUS, 2016).

Segundo VOGEL et al., 2015, a capacidade antioxidante dos compostos fenólicos é superior quando comparada às vitaminas C e E, devido ao sinergismo entre as substâncias e variam de acordo com as condições agronômicas como, a origem da cultivar, condições climáticas, manejo da cultura e condições de armazenamento das folhas (IRAKLI; CHATZOPOULOU; EKATERINIADOU, 2018; ÖZCAN; MATTHÄUS, 2016)

A ingestão destes compostos, sua atividade antioxidante e sua biodisponibilidade são importantes para o conhecimento da matéria prima e seu melhor uso. São inúmeros os benefícios dos produtos e subprodutos da cultura da oliveira. Muitos destes benefícios são conhecidos desde a antiguidade e mesmo em tempos atuais, vários são os trabalhos com descobertas mais aprofundadas sobre os princípios ativos do fruto, das folhas e do azeite. Contudo, poucos são os conhecimentos agronômicos e fitoquímicos dos materiais produzidos no país, como também de seus subprodutos, uma vez que grande parte dos materiais resultantes de poda dos olivais são todos descartados, sem destino produtivo efetivo. As folhas da cultura que são produzidas em grandes quantidades, devido ao grande poder vegetativo da oliveira em condições tropicais aportam escassos lucros de momento. As eventuais propriedades benéficas das folhas aliadas à necessidade de valorizar estes produtos conduziram a este projeto de pesquisa, que visa averiguar o seu real valor e eventual exploração industrial.

METODOLOGIA

1. Material

Os materiais a serem avaliados serão as folhas de três variedades de oliveira, sendo estas: Arbequina, Arbosana e Koroneiki, cultivadas no município de Delfim Moreira.

Estas folhas serão colhidas nas quatro estações no período de dois anos e a coleta será realizada na última quinzena de cada estação, como demonstrado pela Tabela 1 a seguir:

Tabela 1. Épocas de coletas das folhas

Estações

Data da coleta

Outono

11/jun

Inverno

12/set

Primavera

11/dez

Verão

10/mar

A partir de estudos preliminares já realizados para avaliar a eficiência da extração dos compostos fenólicos foi obtido que o melhor solvente de extração foi o etanol 50%. O conteúdo de fenóis totais  de cada cultivar, de cada estação e de cada ano será avaliado conforme descrito em WATERHOUSE, 2002.

1. Análise Cromatográfica

A extração será realizada de acordo com o método descrito em VINHA et al., 2002. A amostra será misturada com o etanol até a extração completa destes compostos. O extrato será filtrado e evaporado sob pressão reduzida (40ºC). Posteriormente, este extrato será dissolvido novamente em etanol (4 mL), dos quais 20 μL serão injetados no HPLC. Os padrões à serem análisados serão: oleuropeína, luteolina-7-glicosídeo, apigenina-7-glicosídeo, ácido cafeico, ácido clorogênico, rutina, quercetina.

Para a quantificação dos compostos fenólicos no extrato de folhas de Olea europaea L, o extrato será dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), na proporção de 5 mg/mL e a solução será filtrada por uma membrana nylon 0,45 milímetros.

O equipamento HPLC utilizado será um Hewlett-Packard Série HP 1100 equipado com um detector de arranjo de diodos. A fase estacionária será um C18 LiChrospher 100 coluna analítica (4 mm de diâmetro) com um tamanho de partícula de 5 milímetros (Merck, Darmstadt, Alemanha) termostatizado a 30ºC. A taxa será de 1 mL/min e as mudanças de absorbância serão monitoradas a 280 nm. As fases móveis utilizadas na cromatografia, serão: (A) ácido acético/água (2,5:97,5) e (B) acetonitrila.

Um gradiente linear será executado a partir de 95% (A) e 5% (B) a 75% (A) e 25% (B) durante 20 min; alterada para 50% (A) e (B) em 20 minutos (40min, tempo total ); em 10 minutos mudará de 20% (A) e 80% (B) (50 min, tempo total). Depois do reequilíbrio em 10 min (60 min, tempo total).

A identificação dos compostos fenólicos do extrato das folhas de oliveira será realizada comparando os seus tempos de retenção com os correspondentes padrões e pelos seus espectros de UV obtidos com o detector de arranjo de diodos.

1. Determinação do potencial antioxidante

Para a determinação da atividade antioxidante das folhas de oliveira, serão utilizadas duas metodologias, sendo estas os métodos de DDPH, descrito por MENSOR et al., 2001 e pelo método de ORAC descrito por DÁVALOS; GÓMEZ-CORDOVÉS; BARTOLOMÉ, 2004.

            3.1 Método de DPPH

O método de DDPH é realizando com o reagente de mesmo nome (DPPH - 1,1 difenil-2-picrilhidrazila da Sigma-Aldrich) e consiste em um radical livre relativamente estável. Para cada amostra, serão utilizados 60 mg da amostra seca homogeneizada com 20 mL de etanol 95%, cuja solução será posteriormente filtrada.

Será construída uma curva de calibração com pelo menos 5 concentrações distintas das amostras em etanol (250, 125, 100, 50 e 10 µg/mL). Será adicionado 1 mL da solução sequestrante de DPPH 0,3 mM em etanol e as reações serão incubadas por 60 minutos em temperatura ambiente.

Paralelamente, será feito um controle negativo com o DPPH a 0,3 mM em etanol para observar o decaimento do radical contra antioxidantes doadores. A leitura obtida a 518 nm, será convertida em porcentagem de atividade antioxidante e o valor estimado para 50% da inibição, valor de CE?? (µg/mL), será calculado por regressão linear, segundo método descrito em MENSOR et al., 2001.

Este método se baseia na redução deste radical livre, relativamente estável, DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidrazila) (Sigma-Aldrich), em solução alcoólica, que na presença de antioxidantes doadores de hidrogênio, captura estes elétrons mudando a coloração de violeta para amarelo, passando para sua forma estável, DPPH-H?. O índice de atividade antioxidante será determinado de acordo com SCHERER; GODOY, 2009, onde: IAA<0,5= pobre atividade antioxidante; 0,5<IAA<1,0=moderada; 1,0IAA2,0= forte; >2,0= muito forte.

3.2 Método de ORAC

Para a avaliação da atividade antioxidante também será realizado o método de ORAC de eliminação de radicais peroxílicos, segundo a metodologia de DÁVALOS; GÓMEZ-CORDOVÉS; BARTOLOMÉ, 2004, usando uma microplaca leitor FLUOstar Omega (BMG LABTECH).

O meio de reação utilizado será tampão fosfato de potássio (pH 7,4, 75mM). A reação será realizada a partir de 20 μL de extrato das folhas de oliveira ou as diferentes concentrações de Trolox. Adicionando-se 120 μL de fluoresceína (0,4 μg/mL) e 60 μL de radical AAPH (2,2′-azobis (2-metilpropionamidina) dicloridrato) (108 mg/mL) na microplaca. A leitura será realizada com temperatura controlada de 37ºC a cada 1 min por um total de 80 min, utilizando os comprimentos de onda de 485nm e 520nm, correspondendo aos comprimentos de onda de emissão e excitação, respectivamente.

Para os resultados do experimento de ORAC será calculada a equação de regressão com as diferentes concentrações de Trolox e a partir dela os resultados serão relacionados com a área líquida sob a curva de decaimento cinético da fluoresceína.

1. Análise da biodisponibilidade dos compostos fenólicos

Para a análise da biodisponibilidade de fenóis o emprego das células Caco-2 tem se mostrado aplicável há alguns anos em estudos de absorção e transporte intestinal de fenóis. Nesta técnica, os alimentos são submetidos à simulação da digestão péptica seguida da digestão intestinal, na presença das células Caco-2. Além de estimar a solubilidade e absorção, este modelo também fornece uma estimativa do transporte do composto de interesse.

O emprego das células Caco-2 associada ao processo de digestão apresenta um grande avanço, quando comparado ao uso apenas da digestão in vitro, pois permite verificar a absorção do nutriente após a digestão do alimento em pHs semelhantes àqueles encontrados ao longo da superfície de absorção do trato intestinal.

Alguns trabalhos compararam a biodisponibilidade dos fenóis empregando métodos de digestão in vitro associados a culturas de células Caco-2 e verificaram boa correlação com valores obtidos em estudo com humanos, assim a metodologia a ser adotada será a de QUARONI; HOCHMAN, 1996.

5. Análise Estatística

Os resultados serão submetidos à análise de variância (ANOVA – two way), teste t para comparação de médias e análise de componentes principais (PCA) pelo software Action Stat 3.5.